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DEAE葡聚糖凝膠A-50實驗試劑使用方法
閱讀：123 發布時間：2021-11-4| 提 供 商 | 上海古朵生物科技有限公司 | 資料大小 | 15.8KB |
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| 資料圖片 | 下載次數 | 7次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數 | 123次 |
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產品名稱：DEAE葡聚糖凝膠A-50
英文名稱：DEAE-Sephadex A-50
外觀（性狀）：白色粉末
規格：25g
基質：Sephadex
顆粒大小：40-120μm
最大流速：45cm/h
工作pH：2-9
操作溫度：室溫
保存條件：室溫
產品簡介
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉變為OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為PH6.85-7.5)，其余均屬酸性蛋白。在PH7.2-7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。
實驗步驟
1、預處理
稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去上層細粒。
按每克A-50加0.5M NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5M NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5M HCl同上操作過程處理，最后以0.5M NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中過夜。
2、裝柱
(1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。
(2)將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。
(3)關閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3、平衡
啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口，停止平衡。
4、加樣及洗脫
啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應<床體積的2％，蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12～14滴／分鐘。
5、 收集
開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6、測蛋白
以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。
7、合并、濃縮
將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG(MW6000)洗縮至所需體積，加入0.02％NaN３防腐劑，于4℃保存備用。
8、A-50凝膠的再生
在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中４℃保存；近期不用時，以*洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內保存。
(四) 注意事項
1 .柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
2. 純化過程必須嚴格控制脫緩沖液的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后，才能進行柱層析。
3.所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。
4.洗脫過程中應嚴格控制流速，且勿過快。
5. 上樣的體積要小，濃度不宜過高。
6.加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。