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Whatman 離子交換纖維素在實驗室中的用法
閱讀：996 發布時間：2018-11-8Whatman 離子交換纖維素在實驗室中的用法
有關如何使得介質獲得結果
達到分離結果
Whatman 公司已為蛋白質、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開發了一系列Whatman 離子交換纖維素。在使用時只有確切的按注意事項操作才能得到分離效果。
介質種類
| 類型 | 陰離子交 | 陽離子交 | 物理形態 |
| 干品 | DE23 | CM23 | 纖維狀 |
| DE23 | CM32 | 微粒狀 | |
| 預溶脹 | DE51 | CM52 | 比52 型結合力較弱的微粒狀 |
| DE52 | 微粒狀 | ||
| DE53 | 比52 型結合力較弱的微粒狀 | ||
| QA52 | SE52 | 全離子化微粒 | |
| SE53 | 比52 型結合力強的全離子化微粒 |
交換劑的預處理
1． 預溶脹（51，52 和53）型離子交換劑不用預先反復處理就可使用。但必須用緩沖鹽充分平衡。預溶脹的離子交換劑在每次預處理或再生后使用不要用任何方法使它變干。
2． 為了得到盡可能好的結果，對于干的離子交換纖維素（23 和32）預處理的每一步必須按下面即將介紹的流程進行操作。
3． DE51、QA52、SE52 和SE53 含防腐劑。此類物質會在平衡和裝柱時自動隨之除去。如果離子交換劑還進行平衡，則防腐劑可以用蒸餾水或者去離子水進行洗滌。
*部分 干型離子交換纖維素
預處理
1． 稱量好的的離子交換劑添加到 15 倍容積（W/V）酸或堿溶液中輕輕攪動，進行*次處理。
2． 微粒產品至少浸泡 30min，纖維狀產品至少浸泡60min。
3． 濾出上清液，用水洗至下列“中間 pH”。
4． 再用 15 倍容積的酸或堿溶液浸泡進行二次處理，放置30min，濾出上清液。
5． 重復上述“4”二次處理，然后用水洗至洗液呈中性。
處理條件
| 型號 | 一次處理 | 中間 pH | 二次處理 |
| DE | 0.5NHCl | 4.0 | 0.5NNaOH |
| CM | 0.5NNaOH | 8.0 | 0.5NHCl |
注意：對預溶脹的微粒狀產品（51，52 和53 型）不需進行這一步，因此干型產品用在大規
模柱層析分離更好。
一般操作注意事項
- 離子交換劑可以在室溫下儲存
- 當不用時可以一直密封保存
- 可以用蒸餾水，更好的是使用去離子水
- 為了避免離子交換劑顆粒變細，不可以激烈窯洞或者攪動交換劑懸液
- 為了延長使用期，離子交換劑不可以采用濃酸、濃堿或強氧化劑處理。為了再生。滅菌和去熱源，可以采用0.5N-2.0NNaOH 處理48 小時。
- 不添加防腐劑情況下，離子交換劑在緩沖液和多聚電解質溶液中不要超過一周。陽離子交換劑（CM 和SE 類）采用0.1%（W/V）疊氮鈉、0.1%（W/V）2,2’-二硫雙（氧化吡啶）或0.02%（W/V）乙基汞硫化*。陰離子交換劑（DE 和QA 類）用0.2%（W/V）烷基-二甲機-芐基氯化銨。
第二部分預溶脹型離子交換纖維素和預處理后的干型離子交換纖維素
交換劑懸浮液的準備
一般 QA52 型和SE52 型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液中平衡時間比DE52 和CM52 型更短。
而且所有介質當采用的緩沖液離子與離子交換劑的相一致時，所需的平衡液體積zui小，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris HCl Buffer）對DE 或QA 型離子交換劑平衡所需時間和體積都要比用醋酸鹽類緩沖鹽少。
所有情況下實際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高，（典型的高10 倍），這樣有利于交換劑的預平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。
離子交換劑裝柱后在進樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進行平衡，通常將2-4 倍柱床容積的低濃度緩沖液通過填充柱就可以完成平衡。
*的方法
1． 在使用之前用緩沖液（0.2-1.0M）輕輕搖動攪拌離子交換劑2-3min。zui初取干型纖維素時每克干品約用15-30mL 緩沖液，濕離子交換劑約用6mL/g。
2． 在攪拌時緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH 調到所希望的值。
3． 讓懸液沉降并傾出上清液中的細小顆粒。
4． 再次使用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總容積按 30mL/g 計，濕離子交換劑約為6mL/g。
5． 離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無灰塵、無直射陽光和不發熱的地方，沉降時間可按t = nh 式計算。式中：t = 時間（min），h = 量筒中懸液總高度（cm），n = 系數可取1.3~2.4。
6． 注意“濕沉降體積”是離子交換劑在規定條件下沉降后所占的體積。除去上清液中所含細粒后留在量筒中的zui終體積是“濕沉降體積”加20%。
7． 填裝短柱或長柱時懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產品的長柱床的密度需用“濕沉降體積”加50%。
變換緩沖液可用的方法
1． 按上項（1）那樣輕輕攪拌離子交換劑到一定容積的緩沖液中。
2． 放置 10min，傾出或濾出上清液。
3． 重復處理直到濾液或上清液確實與緩沖液的 pH 和電導率一樣為止。變換緩沖液后必須
核對pH。當采用低濃度緩沖液時本方法會有所變化，且需要增加處理的時間。
4． 除去細顆粒和裝柱的準備工作請按上述（4）（5）和（6）項進行。
裝柱
在裝柱時必須避免離子交換劑和緩沖液的對流翻動。
為此必須使懸浮液倒入柱中瞬間使離子交換劑形成沉降柱床曾，操作進行得盡可能快，否則懸液中的對流需很長時間才會停下來。
1． 離子交換用柱應該垂直置于無灰、無直射陽光和不發熱等環境中。
2． 假如選液體積大于柱體積時，應該另外接一段延長管。
3． 輕輕攪動下將懸液倒入柱中。
4． 讓洗脫液從柱中排出。
5． 全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。
6． 緩沖液用泵或流動法通過柱子，流速控制至少 45ml/hr/cm2 柱子內截面積，直到柱床高
度恒定。
7． 停止緩沖液流進或流出柱子。
8． 取下延長管（若裝著）并換上柱頂蓋。
平衡
需要強調的是必須正確讀取 pH 和電導率。
對真正的平衡而言平衡后的溶液應該與起始緩沖液一致，必須做到不僅連續兩次平衡溶液的讀數相同，而且要去起始緩沖液相同。不正確的平衡是產生無重現性結果的原因。起始緩沖液流過柱子直到流出液的電導率和 pH 地與起始緩沖液相同。此方法適用于開始時用低濃度緩沖液的柱分離。
樣品準備和加樣
樣品溶于起始緩沖液中并調整溶液的 pH。細胞提取物和硫酸銨沉淀物要用層析柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無法重現的結果。被分離物通常在低流速時加樣。
洗脫
加樣品后立刻開始洗脫或在規定時間內開始。
層析分離通常采用三種方法。有分步洗脫、連續梯度洗脫和分段梯度洗脫。
分步洗脫
離子交換劑平衡和樣品混合物準備時所有緩沖液也可在洗脫時用，洗脫可以有兩種方式完成：
1． 目的物分子是游離狀態的。所需離子交換劑量要根據混合物污染程度、結合力和成分不
同而定。柱床高度在這種方式操作中并不重要。
2． 目的物分子是結合狀態的。層析時混合物是由相類似的成分組成的，為了獲得分離
應選用相對長的柱子。可取的是只用了柱總容量的很小一部分（如5%）。
應避免離子交換劑平衡和柱中層析分離兩者選用不同的緩沖液，除非系統已經明確顯出
會得到錯誤的結果時才考慮。
梯度洗脫
連續地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當的pH，或者兩者都改變。緩沖液本身是達到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對目的化合物的交換容量而定。萬一混合物含層析相近似的組分時，為了獲得好的分辨力需要稍增加些柱長度。
特殊技術
滅菌
所有 whatman 離子交換介質除P11 型之外為了滅菌都可以高壓滅菌。是離子交換劑用PH6.5~7.5 的非揮發性緩沖液配成的懸液中進行。
建議的滅菌條件是 10psi/15min；或者15psi/10min；。另外除P11 型之外所有的產品也可
以用化學滅菌法，將介質分散在0.5MNaOH 中，然后用滅菌水洗滌。所有產品也可用含
20~25%體積百分比的乙醇水溶液處理。
脫氣（對陰離子交換劑）
對大多數靈敏的分離，為了獲得重現性好的結果，DE 和QA 纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預先按上述*的方法處理過后一般就不必進行這一步。
1． 將纖維素加到酸性緩沖液中。
2． 調整 pH 在4.5。有時甚至要用更高濃度的酸溶液來調節pH。
3． 在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg 以下）直到沒有更多的氣泡產生，在不產生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進行，抽濾瓶與吸氣器相連。
4． 加堿性緩沖液使得所希望的 pH。對要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO2 的水配制以保證無CO2。
采用含醇緩沖液
對 SE53 型介質需要含醇緩沖液，平衡時先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統完成平衡。
分批法離子交換
1． 將一定量的已預處理并平衡過無細粒的離子交換劑加到原溶液中。
2． 按原溶液中所含成分的容量攪動一定時間進行吸附分離。
3． 用過濾法或者離心法將離子交換劑和緩沖液分開。
4． 用平衡時所用緩沖液洗滌離子交換劑。
5． 在攪動流化床下或離心下解吸，也可以將纖維素裝柱后用上述洗脫技術進行解吸。